• 海螺集团党委组织召开今年第五次中心组学习会 2019-04-11
  • 13岁少年杀3幼童被收容教养 下调入刑年龄可控犯罪 2019-04-06
  • 《在人间》第152期:美国穷困之地的华裔 2019-04-05
  • 黄渤挑战苏绣“一出好戏” 2019-04-05
  • 文创大咖齐聚成都 共话“一带一路”文化交流 2019-03-30
  • 全国政协经济委员会副主任杨伟民:房地产市场成定时炸弹,行政措施已不能根治。 2019-03-30
  • 合肥一6万元旧车竟卖出20万天价 背后原因让人愤怒! 2019-03-24
  • 2018“我们的中国梦”文化进万家活动在兰考启动 2019-03-13
  • 未来十天 山西以对流性天气为主 多阵性降水 2019-03-13
  • 天呐!山海经竟然是部上古食谱? 2019-02-28
  • 贫血吃什么?这些补血妙招别错过 2019-02-28
  • 花3000吃顿饭不如跟“九星米其林大厨”学道菜 2019-02-27
  • 巢湖今年首个虾汛开湖 1600多户渔民下湖捕捞 2019-02-27
  • 21世纪中国的马克思主义 2019-02-18
  • 汽车--山西频道--人民网 2019-01-30
  • 文献赏析

    华盈视角:蛋白芯片技术应用于砒霜靶点寻找

    2019/01/22

    重庆时时彩有官方投注 www.lttf.icu

        As2O3这一古老的中药在急性早幼粒细胞白血?。ˋPL)治疗中的作用明确,并且对其它恶性肿瘤也具有显著治疗效果。As2O3直接作用靶点的鉴定是揭开其作用机理的最关键一环,然而该科学问题一直困绕着药学研究领域的专家学者们,华盈生物紧密合作伙伴上海交通大学陶生策教授课题组研究人员,应用高通量的人类蛋白质组芯片技术找到了360个特异性的砒霜(As2O3)结合蛋白,这些蛋白很大一部分都参与了糖酵解通路。本研究揭示了As2O3通过抑制糖酵解途径的限速酶己糖激酶2(HK2),抑制细胞代谢引发肿瘤细胞凋亡的作用机制。此外,这项工作中鉴定的As2O3结合蛋白有望成为开发协同抗肿瘤治疗策略的宝贵资源。该研究成果被美国科学院院报(PNAS)收录(PMID:26598702),同时被评为小分子药物靶点研究的经典范文。

     

    文章.png


    文献解读

     

     

     

     

     

    1、As2O3靶标蛋白筛选

    为了鉴定As2O3的结合蛋白,研究人员采用Huprot 20K人类蛋白质组芯片(覆盖2万种人类全长蛋白),该芯片是通过将As2O3生物素化,与芯片一起孵育,并添加Cy3-链霉亲和素(Cy3-SA)鉴定As2O3的结合蛋白(图1A)。因此,研究人员设置了实验组As2O3-Biotin)和对照组(Biotin),为了确保结合的特异性,研究人员还设置了竞争组,即首先将100μM As2O3与芯片孵育,然后用10μM As2O3-Biotin +100μM As2O3与芯片进行孵育,发现As2O3-Biotin与芯片的结合都消失了。图1B是随机选择的实验组和对照组芯片上的相同区域,显示实验组有更多的阳性信号。最终,研究人员共鉴定出360种与As2O3直接相互作用的蛋白。图1C展示了其中部分结合蛋白,其中PML是已知的As2O3结合蛋白。


    图1.jpg

    图1 As2O3靶标蛋白筛选

     

    2、As2O3靶向糖酵解通路

    为了深入了解As2O3结合蛋白的功能作用,研究人员使用DAVID数据库对这360个结合蛋白进行GO分析和KEGGpathway分析,结果都显示糖酵解相关蛋白的显著富集(图2A-B)。并构建了As2O3结合蛋白的相互作用网络,其中最紧密连接的簇(Cluster 1)由参与糖酵解途径或与糖酵解途径高度相关的许多酶组成(图2C)。为了评估在新鉴定的As2O3结合蛋白中是否存在共有序列,研究人员基于一级氨基酸序列进行了MEME基序检索, 确定了许多蛋白包含半胱氨酸(图2D)。该结果也与已知的As2O3对半胱氨酸的高亲和力一致,特别是对于许多相邻的半胱氨酸。


    图2.png

    图2 As2O3靶向糖酵解通路

     

    3、As2O3与HK2结合并抑制其体外活性

    鉴于As2O3结合蛋白的多数被鉴定为糖酵解酶,研究人员对As2O3结合及其对糖酵解的关键酶的功能性结果进行了更详细的体外表征。其中糖酵解酶HK1是As2O3的结合蛋白,因此研究人员也对HK2进行研究。尽管HK2不在人类蛋白质组芯片上,但已知该蛋白在快速生长的肿瘤中维持高葡萄糖分解代谢率方面起关键作用,并且与HK1高度同源。因此,研究人员推断As2O3也可能与HK2结合。WB实验表明,As2O3与HK2及其他糖酵解酶结合,并且加入As2O3解毒剂BAL后,结合作用显著降低(图3A)。研究人员利用生物膜层干涉技术(BLI)测定PML和HK2对As2O3的结合亲和力,发现它们与As2O3的相互作用相当强(Kd分别为860 nM和12.3 nM)(图3B)。


    进一步,研究人员使用链霉亲和素琼脂糖亲和力测定法研究了As2O3是否直接结合细胞内的HK2。首先将HEK293T细胞与As2O3-Biotin一起孵育,将细胞裂解物与链霉亲和素-琼脂糖一起孵育以分离As2O3结合蛋白,然后通过变性将其与琼脂糖解离并用抗HK2检测。如图所示,As2O3-Biotin确实与细胞内的HK2结合,并且这种结合可以通过预先加入As2O3而减弱(图3C)。


    接着,研究人员测定了As2O3结合HK2后对HK2活性的影响,发现2μM As2O3在体外急剧抑制HK2的活性,显著降低葡萄糖-6-磷酸(G6P)反应产物(图3D)。


    图3.png

    图3 As2O3与HK2结合并抑制其体外活性


    4、HK2过表达逆转As2O3诱导的细胞凋亡

    已有研究表明,As2O3处理癌细胞时会导致显著的生长抑制和凋亡。因此,研究人员猜测As2O3对癌细胞的这些有害作用的可能机制之一是通过As2O3对HK2的抑制性结合来介导的。为了验证这一假设,研究人员在胃癌细胞系SGC7901细胞中过表达HK2(图3A-B),用As2O3处理这些细胞,并通过流式细胞术监测细胞凋亡。结果显示,用As2O3处理细胞12小时后,在对照细胞中显著诱导细胞凋亡(18.1%),但在HK2过表达的细胞中凋亡率降至1.32%(图3C-D)。


    图4.png

    图4 HK2过表达逆转As2O3诱导的细胞凋亡

     

    5、HK2是体内As2O3的靶标

    因为As2O3与直接参与糖酵解通路的大部分酶结合并抑制HK2的活性,研究人员假设As2O3处理的癌细胞中该通路的许多代谢物将发生显著变化。为了测试这种可能性,在胃癌细胞系SGC7901中进行了这些代谢物变化的系统分析。糖酵解的第一步和限速步骤由己糖激酶(癌细胞中的HK2)催化(图5A)。代谢组学分析显示,用As2O3处理12h的细胞中己糖激酶的直接产物G6P浓度低于对照细胞,甚至在24h更低(图5B)。此外,用As2O3处理24h的细胞中乳酸的浓度(糖酵解程度的指数)也低于对照细胞(图5C)。为了排除As2O3处理后改变了细胞中葡萄糖的浓度,而导致较低浓度的G6P和乳酸的可能性,对SGC7901细胞中葡萄糖的浓度进行研究,发现在所有时间点,As2O3处理细胞中葡萄糖的浓度与对照细胞没有显著差异(图4D)。这些结果表明As2O3显著抑制糖酵解,并表明抑制己糖激酶活性是细胞内这种作用的主要因素。


    图5.png

    图5 HK2是体内As2O3的靶标


    药物靶点研究路线

     

    图6.jpg


    小结:

    在本研究中,利用人类蛋白组芯片技术找到As2O3的直接结合蛋白对于揭开As2O3抗癌机制的大幕十分关键。在近30年的研究中,研究人员采用传统方法找到的As2O3直接作用靶点不超过20个,大部分研究都是从转录组和蛋白表达调控水平去间接解释As2O3的作用机理。陶生策教授的研究成果不仅让学界对于As2O3的作用机理有了更新的认识。同时,该研究的技术路线为小分子药物靶点的筛选和机制研究提供了新的技术示范。即通过蛋白质组芯片技术快速寻找经典小分子药物的直接作用蛋白,阐明药物调控机理。

    人类蛋白组芯片在筛选互作蛋白研究中具有如下特征性优势:

    1. 芯片实验为体外实验,芯片上每个蛋白点相互独立,保证筛选到的互作蛋白均为目标蛋白的直接结合蛋白,数据分析简单。

    2. 体内环境复杂,很多蛋白结合现象稍纵即逝,很难捕捉,利用体外环境条件下的筛选,可以很快发现很多潜在结合靶标,结合每个蛋白的生物学功能再进行后续实验验证的实验策略更加高效,数据也更加全面。

    3. 在不同组织、细胞、细胞器中,蛋白的表达丰度差异很大,传统的CO-IP等实验很难发现低丰度蛋白的互作现象,人类蛋白组芯片上的蛋白是酵母纯化表达的蛋白,可以保证每种蛋白的丰度,芯片实验容易发现潜在蛋白互作现象。

    4. 利用人类蛋白组芯片实验筛选互作蛋白,从蛋白质层面分析互作数据,避免了CO-IP后质谱鉴定时,从多肽水平跨层分析互作蛋白的不确定性和复杂性。

    5. 相比酵母双杂交实验,蛋白芯片实验周期短、假阳性率低,方便复杂实验设计,可以设计多种实验对照,更能确?;プ鞯鞍资莸淖既沸?。

     

    英文文献链接:

    https://www.pnas.org/content/112/49/15084.long

     

  • 海螺集团党委组织召开今年第五次中心组学习会 2019-04-11
  • 13岁少年杀3幼童被收容教养 下调入刑年龄可控犯罪 2019-04-06
  • 《在人间》第152期:美国穷困之地的华裔 2019-04-05
  • 黄渤挑战苏绣“一出好戏” 2019-04-05
  • 文创大咖齐聚成都 共话“一带一路”文化交流 2019-03-30
  • 全国政协经济委员会副主任杨伟民:房地产市场成定时炸弹,行政措施已不能根治。 2019-03-30
  • 合肥一6万元旧车竟卖出20万天价 背后原因让人愤怒! 2019-03-24
  • 2018“我们的中国梦”文化进万家活动在兰考启动 2019-03-13
  • 未来十天 山西以对流性天气为主 多阵性降水 2019-03-13
  • 天呐!山海经竟然是部上古食谱? 2019-02-28
  • 贫血吃什么?这些补血妙招别错过 2019-02-28
  • 花3000吃顿饭不如跟“九星米其林大厨”学道菜 2019-02-27
  • 巢湖今年首个虾汛开湖 1600多户渔民下湖捕捞 2019-02-27
  • 21世纪中国的马克思主义 2019-02-18
  • 汽车--山西频道--人民网 2019-01-30
  • 3d试机号金码 福建时时彩规则倍数 排列五走势图2元网坐标带连线 17500乐彩网p3试机号 竟彩足球胜平负分析 混合过关投注技巧 竞猜半全场怎么看 极速时时彩是谁开的 三分彩走势图 北京时时彩赛车微信群 山东时时彩计划软件 中国足彩网500 购买彩票 北京赛车长龙历史记录 奔驰线上娱乐平台 七星彩走势图